温敏水凝胶因能模拟细胞外基质微环境，且具有原位注射性和形态适应性，在骨组织工程中应用广泛。小肠黏膜下层（SIS）作为天然细胞外基质来源，富含 I 型和 III 型胶原蛋白及多种生物活性因子，其制备的水凝胶在组织修复中展现出良好潜力，然而其机械性能较弱，在体内复杂应力环境下易坍塌，限制了临床应用。

此外，骨再生微环境的构建离不开细胞、细胞因子等活性物质的参与，骨髓间充质干细胞（BMSCs）因其自我更新和多向分化能力，在骨损伤修复中具有天然优势，但直接干细胞移植存在归巢效率低、潜在致瘤性等风险。

外泌体作为细胞自然分泌的纳米囊泡，通过传递 mRNA、miRNA 及蛋白质调控细胞间通讯，具有稳定性高、免疫原性低及天然归巢能力等特点，其中 BMSCs 来源的外泌体（BMSCs-Exs）已被证实具有与亲代细胞相似的成骨诱导能力，为无细胞骨修复策略开辟了新途径。​

尽管外泌体疗法优势显著，但其在骨再生中的应用仍面临挑战。目前外泌体与水凝胶的结合多采用直接混合法，存在负载效率低、外泌体结构易破坏及成骨潜力受抑等问题。为解决这一难题，多功能融合肽作为由多个肽链组成的递送系统，在活性物质靶向递送中展现出优异性能。

研究表明，CP05 肽（CRHSQMTVTSRL，AbMole，M58139）可特异性识别外泌体表面标志物 CD63，而 TKKTLRT 和 KELNLVY 作为胶原结合域（CBD），能分别与 SIS 水凝胶中的 I 型和 III 型胶原特异性结合。CP05 | AbMole | CRHSQMTVTSRL 此外，刚性连接子 EAAAK 含 α- 螺旋结构，通过氢键维持融合肽的结构稳定性，可避免功能域的错误折叠。基于此，本研究设计了系列融合肽，通过直接或经 EAAAK 连接 CBD 与 CP05，旨在实现外泌体向 SIS 水凝胶的高效递送，同时引入 3-（3,4 - 二羟基苯基）丙酸（CA）增强水凝胶的机械性能，最终构建具有优异骨再生能力的新型功能水凝胶体系。​

BMSCs 分离自 SD 大鼠骨髓，采用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基在 37℃、5% CO₂条件下培养，通过差速离心法分离外泌体：收集无血清培养基，依次经 300×g 离心 15 分钟、2000×g 离心 20 分钟去除细胞碎片，0.22μm 滤膜过滤后，100,000×g 超速离心 3 小时获得外泌体，采用 BCA 法定量蛋白浓度，透射电镜观察形态，纳米颗粒跟踪分析（NTA）测定粒径分布，Western blot 检测标志物 Alix、CD9、CD63 的表达。​

SIS-CA 水凝胶的制备过程如下：取猪空肠，机械去除黏膜层和肌层，经甲醇 - 氯仿混合液脱脂、胰酶消化、SDS 处理及过氧乙酸灭菌后，冻干并粉碎为絮状，用 3% 乙酸和 0.1% 胃蛋白酶消化 48 小时制备 10%（w/v）SIS 预凝胶。将 CA 溶解于蒸馏水中配制成 0.5M 溶液，与 SIS 预凝胶混合，用 2.5M NaOH 调 pH 至 7.0，37℃孵育 30 分钟形成 SIS-CA 水凝胶。融合肽与外泌体的复合体系构建：将 P1 与 P2、P3 与 P4 分别混合（终浓度 200μM），加入 300μL 1μg/μL BMSCs-Exs，随后将 SIS-CA 水凝胶在 25℃下浸入上述混合液 30 分钟，获得 P1&2 SIS-CA/Exs 和 P3&4 SIS-CA/Exs 水凝胶。​

材料表征采用场发射扫描电镜（SEM）观察水凝胶微观结构，冻干样品经喷金处理后，通过 ImageJ 分析孔径；傅里叶变换红外光谱（FTIR）在 4000-500 cm⁻¹ 范围内分析化学组成；万能试验机测定力学性能，流变仪评估储能模量（G'）和损耗模量（G''）的变化；降解实验中，将水凝胶置于含 100 U/mL III 型胶原酶的 PBS 中，37℃孵育 10 天，按公式计算降解率。外泌体与融合肽的负载情况通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）验证，外泌体用 DiR 标记，融合肽自带荧光标记，经 PBS 洗涤三次后观察荧光分布。​

体外细胞实验采用 BMSCs，通过 Live/Dead 染色和 CCK-8 法评估细胞活力与增殖；12 和 24 小时的细胞黏附实验中，用罗丹明 B 标记肌动蛋白，DAPI 染核，CLSM 观察细胞形态；成骨分化实验中，通过 RT-PCR 检测 Runx2、Alp、Opn 的 mRNA 表达，Western blot 和免疫荧光分析相应蛋白水平。外泌体摄取实验中，DiI 标记的外泌体与细胞共孵育 1 天，CLSM 观察摄取情况；监测 8 天内胶原酶溶液中累积释放量。​

动物实验选用 30 只雄性 SD 大鼠（250-280g），构建 8mm 颅骨缺损模型，随机分为 5 组：空白组、SIS-CA 组、SIS-CA/Exs 组、P1&2 SIS-CA/Exs 组、P3&4 SIS-CA/Exs 组，每组 6 只。手术中植入相应水凝胶，每周注射一次，12 周后处死大鼠，取颅骨进行 Micro-CT 扫描，分析骨体积 / 组织体积比（BV/TV）等参数；标本经 EDTA 脱钙、石蜡包埋，切片后进行 HE 染色、Masson 三色染色和 RUNX2 免疫组化分析。​

统计分析采用 SPSS v22.0 软件，数据以均值 ± 标准差表示，组间比较采用单因素或双因素方差分析，p<0.05 为差异有统计学意义。​

实验结果显示，融合肽的结构预测表明，含 EAAAK linker 的 P3 和 P4 具有更多氢键，骨架结构更紧凑，利于 CP05 捕获外泌体及 CBD 与胶原结合。SIS-CA 水凝胶的 SEM 图像显示，CA 的引入使孔隙结构更致密，孔径从 118.4±38.4μm 减小至 70.5±16.1μm，但对 BMSCs 的浸润深度无显著影响（2 天 12μm，4 天 20μm）。FTIR 分析显示，CA 修饰后酰胺 I 带（1636 cm⁻¹）位移 1 cm⁻¹，透光率降低，表明 CA 与胶原成功交联；力学测试中，SIS-CA 水凝胶的最大载荷（2.8±0.12 N）是 SIS 水凝胶的 3 倍，G' 提高 1.4 倍，坍塌应变从 205% 增至 275%，10 天降解率为 70.9%，显著低于 SIS 水凝胶的 92.4%，证实 CA 有效增强了机械性能和稳定性。​

外泌体表征显示其呈典型杯状结构，粒径 122 nm，表达 Alix、CD9、CD63，不表达细胞溶质标志物 Cytochrome C。CLSM 观察证实，P3&4 SIS-CA/Exs 水凝胶的 DiR 标记外泌体荧光强度高于 P1&2 组，且分布更均匀，表明含 EAAAK 的融合肽提高了外泌体负载效率。浊度测试显示，各组水凝胶的胶凝温度（Tt）无显著差异，维持了温敏特性。​

体外实验中，P3&4 SIS-CA/Exs 组的外泌体 8 天累积释放量为 54.1±2.0%，高于 P1&2 组的 50.4±1.2%，且在炎症因子（TNF-α 和 IFN-γ）刺激下仍能稳定释放。细胞摄取实验显示，P3&4 组的外泌体摄取量最多；Live/Dead 染色和 CCK-8 证实该组细胞活力和增殖能力最强；24 小时时细胞呈纺锤形，肌动蛋白丝排列清晰，黏附效果最佳。成骨分化中，P3&4 组的 Runx2、Alp、Opn 的 mRNA 和蛋白表达均显著高于其他组，表明融合肽与外泌体的协同作用促进成骨分化。​

动物实验中，12 周的 Micro-CT 显示 P3&4 SIS-CA/Exs 组的 BV/TV 为（68.3±5.2）%，显著高于空白组（12.1±3.5）%、SIS-CA 组（32.6±4.1）% 和 SIS-CA/Exs 组（45.8±4.7）%，3D 重建显示缺损区几乎被新生骨覆盖。HE 和 Masson 染色显示，该组新生骨组织均匀分布，胶原纤维丰富；免疫组化中 RUNX2 阳性区域最大，证实成骨活性最强。​

综上所述，本研究通过 CA 修饰增强 SIS 水凝胶的机械性能，设计含 EAAAK linker 的融合肽（P3 和 P4）高效锚定外泌体，显著提高其在缺损部位的保留与稳定性，协同促进 BMSCs 的增殖和成骨分化，在大鼠颅骨缺损模型中实现了优异的骨再生效果。该体系为骨组织工程中的无细胞策略提供了新思路，具有潜在的临床应用价值。在实验过程中，所用到的部分试剂如用于细胞培养和检测的相关产品，其品质保证为实验的顺利进行提供了支持，其中 AbMole 的产品在相关步骤中发挥了重要作用，确保了实验结果的可靠性。