分枝生长是作物农业特性中的一项重要指标，它直接影响植株的结构和作物的产量。黄瓜（学名：Cucumis sativus L.）是一种在全球范围内具有重要经济价值和营养价值的重要蔬菜作物。在田间环境中，具有更多侧枝的黄瓜植株更受青睐以提高产量。虽然光敏色素B（phyB）、分枝蛋白1（BRC1）和脱落酸（ABA）能够促进腋芽的生长，但目前尚不清楚植物界中是否存在它们之间的整合因子。

基于此，近日中国农业大学张小兰/赵剑宇团队于JIPB上发表了一篇名为“The CsphyB-CsPIF4-CsBRC1 module regulates ABA biosynthesis and axillary bud outgrowth in cucumber”的文章，本文结合转录组、ChIP-seq、酵母双/单杂、双荧光素酶等实验发现了一个涉及CsphyB-CsPIF4-CsBRC1的调控网络，该网络整合了光信号和ABA生物合成来调节侧芽生长。这为作物育种中对分支数量的调控提供了一种策略，从而能够实现理想的分支特性，进而最大限度地提高产量。爱基百客为本研究提供了ChIP-seq的技术服务。

图1CsphyB-CsPIF4-CsBRC1调节ABA合成与黄瓜侧芽伸长的工作模型

   结果展示   

一. CsphyB能够促进黄瓜腋芽的生长

在之前的研究中，近等基因系（NIL）-lh1（其在CsphyB基因中存在一个7个碱基的缺失，导致生成的蛋白质仅含有79个氨基酸残基）在幼苗阶段与野生型（WT）Gy14相比表现出额外长的下胚轴。对成年植株的表型特征分析显示，CsphyB突变体（NIL-lh1）的侧枝明显更少且更短，但腋芽的启动未受影响。Gy14的腋芽逐渐伸长以形成分支，但NIL-lh1植株每个节点的枝条长度大幅缩短，并且没有可处理的侧枝（基于农业标准为长度超过4厘米的侧枝）。此外，对野生型PS76进行CsphyB突变呈现出与NIL-lh1一致的表型，确定了CsphyB的功能破坏极大地阻碍了黄瓜腋芽的生长。

图2Gy14（WT）和近等基因系（NIL）-lh1的表型特征分析

二. 遮光处理会抑制黄瓜的侧芽生长

遮阴处理会导致遮阴逃避综合征，表现为胚轴和侧枝的伸长增加、侧枝分支减少以及叶片面积减小。为了探究光信号如何调节黄瓜的侧枝发育，作者对侧枝过多的Sikkim inbred line WI7120进行了遮阴处理。遮阴极大地抑制了WI7120中花芽的生长，并且增加了节间长度，表明遮光抑制了黄瓜的侧芽生长。

图3遮光处理会阻碍WI7120侧枝的生长

三. 脱落酸的生物合成途径与黄瓜中由CsphyB介导的茎枝分枝现象有关

为了确定黄瓜中CsphyB的下游靶点及其调控网络，作者使用来自Gy14和NIL-lh1同一节点的侧芽进行了转录组测序分析。DEG分析与RT-qPCR结果显示CsBRC1（CsGy1G003520，一种抑制黄瓜侧枝生长的关键抑制因子），CsNCED3（CsGy4G007460）、CsNCED5（CsGy6G035690）和CsNCED6（CsGy2G009810）（三个ABA生物合成基因）在NIL-lh1中显著上调表达。由于NCEDs在ABA生物合成的限速步骤中起作用，作者测量了Gy14和NIL-lh1同一节点侧芽中的ABA含量，发现Gy14中ABA的平均浓度低于NIL-lh1，表明ABA的生物合成过程参与了黄瓜植株中由CsphyB诱导的分枝现象。

在这三种差异表达的CsNCED蛋白中，只有CsNCED3在Gy14的侧芽中表达水平较高。因此，作者重点研究了CsNCED3。通过分析CsNCED3的启动子，作者发现了一个可能的顺式作用元件作为CsBRC1的结合位点。为了探究CsBRC1是否能直接调控黄瓜中CsNCED3的表达，作者使用双荧光素酶报告系统、EMSA体外实验进行了转录激活实验验证。为了进一步验证CsBRC1在体内的与CsNCED3启动子的结合，作者生成了表达35S：CsBRC1-Flag构建体的转基因黄瓜系。染色质免疫沉淀测序（ChIP-Seq）分析显示，在CsNCED3启动子区域存在两个CsBRC1结合峰，这些峰涵盖了P1转座子元件。这些结果有力地证明了在黄瓜体内，CsBRC1直接与CsNCED3启动子结合。这些发现表明CsphyB可能通过CsBRC1介导的ABA生物合成来调控黄瓜的侧枝生长。

图4黄瓜中CsphyB可能通过ABA途径来调控黄瓜的侧芽生长

四. CsPIF4与CsphyB相互作用，并直接促进CsBRC1的表达

在拟南芥中，phyB在吸收红光后会从无活性形式转变为有活性形式，并进入细胞核。前期研究中，黄瓜CsphyB在红光下定位在细胞核内，并与CsPIFs相互作用。为了确认黄瓜中CsphyB与CsPIFs之间的相互作用，作者通过同源性比对搜索鉴定出了七个CsPIFs。酵母双杂交（Y2H）实验表明，CsPIF1a、CsPIF1b、CsPIF3和CsPIF4能够与CsphyB相互作用，而分裂荧光素酶互补实验验证了CsphyB与CsPIF3/4在蛋白质水平上的相互作用。

为了探究CsPIFs是否能够直接与CsBRC1结合，作者分析了CsBRC1起始密码子上游的2000个碱基对的启动子区域，并识别出了七个E-box元件，其中包括两个典型的G-box元件（CACGTG）。酵母单杂、EMSA、双荧光素酶实验结果显示只有CsPIF4能够与CsBRC1的P1和P6转录激活元件结合。为了验证CsPIF4与CsBRC1启动子在体内的相互作用，作者生成了一个含有35S：CsPIF4-Flag构建体的转基因黄瓜植株，并进行了ChIP实验。染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）的结果显示，CsPIF4在CsBRC1的启动子区域存在一个结合峰，该启动子区域包含了P6顺式元件。这些结果表明，CsPIF4能够直接与CsBRC1的启动子结合并增强其表达。

图5CsPIF4直接与CsBRC1结合，从而激活其表达

五. CsPIF4的功能障碍导致黄瓜侧枝生长增多

为了探究CsPIF4在黄瓜中的生物学功能，作者利用CRISPR/Cas9系统生成了Cspif4突变体。获得了两个纯合突变株，即Cspif4#1（存在84个碱基对的缺失）和Cspif4#3（存在1个碱基对的缺失），这两个突变株分别导致蛋白质提前终止，长度分别为5个和49个氨基酸。表型特征表明，这两个突变株的侧枝数量、芽生长比例、节间分支长度均多于野生型（“9930”背景）。与野生型相比，Cspif4突变体腋芽中的CsBRC1和CsNCED3的表达水平降低，Cspif4#1突变体中的ABA浓度显著降低。这些结果表明，CsPIF4通过刺激CsBRC1的表达和促进黄瓜中ABA的生物合成来抑制侧枝的生长。

图6黄瓜植株中CsPIF4的缺失会导致侧芽的生长量增加

六. Csnced3突变体中脱落酸的缺乏会促进侧芽的生长

为了探究黄瓜中ABA积累量减少与芽生长加快之间的遗传关系，作者利用CRISPR/Cas9技术培育了两个Csnced3突变株系。Csnced3#1存在一个7个碱基的缺失，而Csnced3#2在第一个靶位点处存在一个1个碱基的插入；这两种突变均导致CsNCED3蛋白翻译的提前终止。表型分析显示，这两个Csnced3突变株系的侧枝数量、长度，芽生长比例、均显著大于野生型（R1461背景）。对侧芽中ABA含量的进一步分析显示，与野生型相比，Csnced3突变体中的ABA含量显著降低。这些结果表明，Csnced3突变体中降低的ABA水平促进了侧芽的生长，这表明ABA在黄瓜的侧枝生长中起着负面作用。

图7黄瓜中CsNCED3的缺失导致黄瓜侧芽的生长量增加

   总  结   

本研究以黄瓜为对象，聚焦研究了光信号与激素调控侧芽萌发的分子机制。作者利用转录组、ChIP-seq、酵母杂交、双荧光素酶报告基因、EMSA等实验结合表型实验挖掘了“CsphyB-CsPIF4-CsBRC1-ABA”的调控网络，阐明该模块通过整合光信号与ABA合成调控侧芽萌发的机制，为作物分枝性状改良提供育种策略。

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