在生命科学领域，蛋白质间的相互作用构成了生命活动的核心网络，驱动着信号传导、基因调控、代谢途径等关键过程。为了绘制这幅复杂的“分子互作地图”，科学家们开发了多种技术，其中免疫共沉淀结合质谱（IP-MS）、Pull down结合质谱（Pull down-MS）以及近年兴起的邻近标记技术（如BioID、APEX）是核心利器。本文将对这三种技术进行详细比较，帮助大家了解它们的优缺点及适用场景。
IP-MS
IP-MS利用目标蛋白（诱饵蛋白）的特异性抗体，在接近生理条件的细胞裂解液中捕获诱饵蛋白，将与诱饵蛋白直接或间接稳定结合的蛋白（猎物蛋白）富集后进行质谱鉴定，从而确定与目标蛋白存在相互作用的潜在蛋白。
实验流程
1、载体构建及细胞转染（如有内源抗体则可省略该步骤）；
2、细胞裂解与抗体孵育；
3、磁珠捕获免疫复合物；
4、洗涤并洗脱免疫复合物；
5、质谱鉴定和数据分析。
技术优势
1、体内生理条件下互作检测和筛选；
2、无需蛋白纯化过程，操作简单；
3、可结合多种处理研究相互作用。
技术缺点
1、对抗体质量依赖高，抗体质量决定实验成败；
2、背景噪音较高，灵敏度低，容易出现假阳性；
3、无法检测弱/瞬时相互作用，并且无法区分直接或间接相互作用；
4、不具备空间分辨率，无法准确定位互作动态变化。
应用案例
2024年3月，浙江大学医学院宋朋红课题组在《Cancer Commun (Lond).》杂志发表题为“SERPINE2 promotes liver cancer metastasis by inhibiting c-Cbl-mediated EGFR ubiquitination and degradation”的研究论文。该团队利用IP-MS检测证实，SERPINE2通过与EGFR相互作用激活表皮生长因子受体（EGFR）及其下游信号通路。在机制上，SERPINE2通过与 E3 泛素连接酶 c-Cbl 竞争来抑制 EGFR 泛素化并维持其蛋白质稳定性。此外，索拉非尼治疗后肝癌细胞中的EGFR被激活，敲低诱导的EGFR下调SERPINE2显著增强了索拉非尼对肝癌的治疗效果。此外，作者还发现SERPINE2敲低对乐伐替尼治疗也有致敏作用。
Pull down MS
Pull down-MS与IP-MS类似，核心也是捕获诱饵蛋白及其互作蛋白，区别在于捕获方式不是使用抗体，而是使用与诱饵蛋白融合表达的标签蛋白（如GST, His, MBP等）或固定化的生物分子配体（如固定化的GTP用于捕获Rho GTPase）进行互作蛋白捕获。
实验流程
1、诱饵融合蛋白表达载体构建；
2、融合蛋白表达纯化；
2、细胞裂解与融合蛋白共孵育；
3、磁珠捕获免疫复合物；
4、洗涤并洗脱免疫复合物；
5、质谱鉴定和数据分析。
技术优势
1、体外直接筛选互作蛋白；
2、无需IP级别抗体；
3、洗脱纯度高，信噪比高。
技术缺点
1、体外筛选，无法反应真实生理情况；
2、需要构建融合蛋白，标签可能影响蛋白结构和表达；
3、需要进行蛋白纯化，受纯化质量影响大；
4、不具备空间分辨率，无法准确定位互作动态变化。
应用案例
2023年8月，广东药科大学李雄课题组在《J Exp Clin Cancer Res》杂志发表题为“AR antagonists develop drug resistance through TOMM20 autophagic degradation-promoted transformation to neuroendocrine prostate cancer”的研究论文。该团队证实 TOMM20的蛋白水平与PCa细胞和标本中的AR呈正相关。TOMM20蛋白与AR发生物理相互作用，AR拮抗剂通过自噬-溶酶体途径诱导TOMM20的蛋白质降解，从而提高细胞内ROS水平，激活PI3K/AKT信号通路。当TOMM20耗尽时，PCa细胞接受EMT，获得癌症干细胞样细胞的特征，并对AR拮抗剂产生耐药性。TOMM20的稳定耗竭促进了PCa腺癌向NEPC的转分化和转移。相反，TOMM20的抢救使耐药PCa细胞对AR拮抗剂重新敏感。
邻近标记技术
邻近标记技术（Proximity labeling，PL）是将具有连接酶活性的酶与目的蛋白融合, 在连接酶的催化作用下将小分子底物连接到与目的蛋白邻近的内源蛋白或核酸分子，通过小分子底物富集蛋白或核酸分子，实现筛选潜在互作蛋白或核酸的目的。
实验流程
1、邻近标记酶融合诱饵蛋白表达质粒构建；
2、细胞培养和质粒转染；
3、底物分子（通常为生物素）标记；
4、细胞裂解并与磁珠共孵育；
5、洗涤并洗脱免疫复合物；
6、质谱鉴定和数据分析。
技术优势
1、体内生理环境筛选互作蛋白；
2、洗脱强度大，信噪比高；
3、不依赖IP级别的抗体和体外纯化的蛋白；
4、具有空间分辨率，能够检测分子间的动态相互作用；
5、能够实现原位标记，分析互作的空间性；
6、能够检测瞬时相互作用或弱相互作用；
技术缺点
1、过氧化物酶对细胞具有一定毒害作用；
2、标记范围有限，并且可能存在非特异性标记；
3、需要对目的蛋白融合邻近标记酶，可能影响目的蛋白表达或构象；
应用案例
2025年1月，中国药科大学天然药物国家重点实验室庞涛课题组在《Acta Pharm Sin B》杂志发表题为“The PGAM5-NEK7 interaction is a therapeutic target for NLRP3 inflammasome activation in colitis”的研究论文。该研究团队证实小鼠敲除PAGM5基因能够通过抑制NLRP3炎症小体的激活改善葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎。借助基于APEX2的邻近标记与定量蛋白质组学，作者确定了有丝分裂丝氨酸/苏氨酸激酶NEK7是PGAM5新的结合蛋白，能够促进以PGAM5磷酸酶活性非依赖性介导的NLRP3炎症小体的组装和活化。使用安石榴素处理则能够干扰PGAM5-NEK7的相互作用，从而抑制巨噬细胞中NLRP3炎症小体的活化并改善DSS诱导的小鼠结肠炎。
如何选择？
1.研究强而稳定的复合物成员，且有高质量抗体时， IP-MS 可能是直接有效的选择。
2.需要严格验证诱饵与猎物是否直接结合时，体外 Pull down-MS 结合生物物理验证是最佳途径。
3.探索未知的、特别是弱/瞬态/依赖于细胞环境的互作网络时，邻近标是首要选择。
4.需要高时空分辨率如信号通路快速响应时，邻近标记技术是唯一选择。
5.研究特定亚细胞区域（如细胞器、膜接触位点）的蛋白质组时，邻近标记是首要选择。
参考文献
[1] Zhang S, Jia X, Dai H, et al. SERPINE2 promotes liver cancer metastasis by inhibiting c-Cbl-mediated EGFR ubiquitination and degradation [J]. Cancer Commun (Lond), 2024, 44(3):384-407.
[2] Yin L, Ye Y, Zou L, et al. AR antagonists develop drug resistance through TOMM20 autophagic degradation-promoted transformation to neuroendocrine prostate cancer [J]. J Exp Clin Cancer Res, 2023, 42(1):204.
[3] Gao C, Song J, Wang H, et al. The PGAM5-NEK7 interaction is a therapeutic target for NLRP3 inflammasome activation in colitis [J]. Acta Pharm Sin B, 2025, 15(1):349-370.
