一、技术背景

单细胞RNA测序（scRNA-seq）自问世以来，极大推动了细胞异质性和组织复杂性的研究。但RNA水平并不能完全代表蛋白质水平，因为蛋白质的表达受转录后调控、翻译效率及蛋白降解等多种因素影响。此外，许多细胞类型的特征依赖于表面蛋白的表达，单纯靠转录组数据难以准确区分。
CITE-seq (Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by sequencing) 技术在 2017 年由 Stoeckius 等人提出，利用抗体标签的DNA条形码标记细胞表面蛋白，并与RNA一起测序，实现了细胞转录组与蛋白质表面表型的联合分析。

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二、技术原理

• 抗体-寡核苷酸偶联物（Antibody-Oligo Conjugates）
  研究人员将单克隆抗体与独特的DNA寡核苷酸条码（ADT，Antibody Derived Tags）偶联，每个抗体对应特定的条码，针对不同表面蛋白。

• 双重标记单细胞
  在细胞悬液中，使用这些抗体混合物与细胞表面靶点结合，完成细胞表面蛋白的特异性标记。

• 单细胞捕获与裂解
  标记完成后，利用微流控芯片或油滴包裹技术捕获单个细胞，细胞裂解后释放的RNA和抗体携带的DNA条码共同进行反转录。

• 文库制备及高通量测序
  RNA和ADT条码分别构建测序文库，进行下一代测序（NGS）。

  • RNA测序获得基因表达谱

  • ADT测序获得蛋白表达量信息

• 数据整合分析
  通过生物信息学方法，将RNA和蛋白质数据结合，得到每个细胞的转录组和表面蛋白双模态信息。

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三、实验流程

1. 抗体标记
   细胞悬液与含有独特DNA条码的抗体混合，进行细胞表面蛋白标记。

2. 单细胞捕获
   使用10x Genomics等平台，将标记细胞单独封装于微滴中。

3. 细胞裂解及逆转录
   裂解细胞释放mRNA和ADT条码，逆转录成cDNA。

4. 文库构建
   分离RNA和ADT条码，分别进行扩增和文库制备。

5. 高通量测序
   使用Illumina测序平台测序。

6. 数据处理

   • RNA数据进行标准scRNA-seq分析（质控、归一化、降维、聚类）

   • ADT数据进行计数和归一化，获得蛋白表达强度

   • 融合两组数据，实现多模态分析

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四、技术优势

• 多模态信息获取：同时得到转录组和蛋白质信息，全面反映细胞功能状态。

• 细胞类型鉴定准确：结合蛋白表达信息可以更准确地区分亚群和状态。

• 低样本需求：和传统流式细胞术相比，对样本量需求更低。

• 兼容现有scRNA-seq平台：可直接在10x Genomics等主流单细胞平台上实施。

• 适合复杂样本分析：肿瘤、免疫微环境、干细胞分化等多领域均可应用。

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五、数据分析特点

• 双模态数据处理：需要针对 RNA 和 ADT 数据分别预处理，常用归一化方法有所不同。

• 多组学融合：主流分析软件如 Seurat、Scanpy 已支持 CITE-seq 数据的联合降维和聚类。

• 去除背景噪声：ADT数据可能存在非特异性结合或背景信号，需要特定算法校正。

• 细胞类型注释：结合蛋白和基因标记更精准，特别是在免疫细胞类型划分中优势明显。

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六、主要应用领域

• 免疫细胞研究
  精准划分免疫细胞亚型，分析免疫应答和免疫治疗机制。

• 肿瘤微环境分析
  同时捕获肿瘤细胞与免疫细胞的转录组和蛋白质信息，解析细胞互作。

• 干细胞与发育生物学
  追踪细胞分化路径，揭示细胞命运决定机制。

• 疾病机制探索
  解析复杂疾病中细胞的多层次状态和功能变化。