CD8⁺T细胞耗竭（T cell exhaustion）是肿瘤免疫治疗的核心瓶颈，其表观遗传重塑机制（如组蛋白修饰）是当前国自然重点资助的前沿方向。耗竭T细胞（TEX）是指在慢性感染（如持续性病毒感染）或肿瘤微环境中长期暴露于抗原刺激后，功能逐渐失调的CD8⁺T细胞。研究显示其在癌症和慢性病毒感染中经历代谢和表观遗传重塑，削弱了其保护能力。然而，营养代谢对控制TEX分化的表观遗传修饰的影响尚不清楚。今天我们带来一篇Science文章《Nutrient-driven histone code determines exhausted CD8+ T cell fates》，该研究针对肿瘤免疫治疗的核心瓶颈——CD8+T细胞耗竭（TEX）展开，首次揭示代谢重编程通过营养依赖的组蛋白修饰决定T细胞分化命运。

• 研究技术：RNA-seq、CUT&Tag、scRNA-seq等（爱基百客均可提供）。

• 核心问题：本研究揭示了乙酰辅酶A合成酶ACSS2和ATP-柠檬酸裂解酶ACLY通过介导不同营养源（乙酸盐vs.葡萄糖）驱动的组蛋白乙酰化，决定TEX细胞分化命运的关键机制。

   研究思路   

   研究结果   

1. ACSS2与ACLY在TEFF（效应T细胞）和TEX细胞中的差异表达模式

为了理解选择性营养物质利用及随后的乙酰辅酶A（acetyl-CoA）生成如何调节CD8+T细胞分化，研究分析了从肿瘤或急性（Armstrong）与慢性（克隆13）淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）感染中分离出的CD8+T细胞中乙酰辅酶A合成酶Acss2和ATP-柠檬酸裂解酶Acly的转录谱（公共单细胞转录组数据，图1A和1B）。另外，研究还从蛋白水平关注了ACSS2与ACLY的表达情况（图1C和1D）。结果表明，随着TEX细胞在肿瘤和慢性感染中发展，它们下调ACSS2表达同时维持ACLY表达。这里研究团队发现了这两种酶在T细胞耗竭中的表达模式不同。

图1：ACSS2表达下调，而ACLY表达在TEX细胞中持续存在。

2. ACSS2和ACLY在TEFF和TEX细胞分化及抗肿瘤和抗病毒免疫中的功能拮抗

使用基因敲除方法研究了ACSS2和ACLY在肿瘤发生和慢性LCMV感染期间TEX细胞形成中的作用。在导致T细胞耗竭的情况下，Acss2的缺失削弱了CD8+T细胞活性，而Acly缺失则增强了它们的功能。

图2：ACSS2促进TEXprog细胞形成及抗肿瘤/抗病毒反应，而ACLY则起抑制作用。

3. ACSS2与ACLY决定了TEFF和TEX细胞对底物的选择性利用

ACSS2和ACLY的差异表达模式及其对TEX细胞形成的影响让研究团队提出假设，即乙酸盐和葡萄糖衍生柠檬酸盐合成乙酰辅酶A的过程可能在功能性效应T细胞和功能障碍性耗竭T细胞之间存在差异。于是，研究团队使用稳定同位素示踪实验来追踪乙酰辅酶A的来源。数据表明TEX细胞倾向于利用葡萄糖而非乙酸生成细胞核乙酰辅酶A，这与ACSS2表达降低相一致。

4. ACSS2和ACLY分别在TEFF和TEX细胞中协调乙酸盐和葡萄糖介导的组蛋白乙酰化作用

为了研究乙酸盐和葡萄糖如何被利用来乙酰化组蛋白，利用同位素示踪（[1,2-13C] acetate 或 [U-13C] glucose）追踪乙酰基的流向，并结合质谱、流式/质谱流式分析特定组蛋白乙酰化位点。结果表明TEFF细胞优先利用乙酸衍生的乙酰辅酶A来完成所有检测到的组蛋白乙酰化位点修饰（图3F），而TEX细胞则倾向于以葡萄糖为主要来源（图3G）。此外，在CD8+T细胞中敲除Acss2和Acly显示，与对照组或缺失Acly的细胞相比，缺乏Acss2的TEXprog细胞基于流式细胞术测量的H3K27ac总量降低了近50%，这强调了TEXprog细胞对ACSS2在维持全局组蛋白乙酰化水平方面的高度依赖性（图3H）。相比之下，Acly的缺失对TEXprog或TEXterm细胞的全局H3K27ac水平没有影响。实际上，它在TEXterm细胞中趋向于增加H3K27ac（图3H），这可能是由于在Acly缺陷细胞中观察到ACSS2的代偿性增加（图3I）。

此外，来自13C-乙酸盐的组蛋白乙酰化在sgAcss2 CD8+ T细胞中受损，而在sgAcly细胞中增加（图3J），这再次与ACSS2代偿一致（图3I）。相反，来自13C-葡萄糖的组蛋白乙酰化在sgAcly或sgAcss2 T细胞之间没有显著差异。这些发现表明，随着CD8+T细胞从TEFF分化为TEX细胞，或更准确地说，从TEXprog向TEXterm细胞发展的过程中，它们对组蛋白乙酰化的依赖从ACSS2转变为ACLY，因此从乙酸盐转变为葡萄糖。然而，TEX细胞无法维持与其功能更强的对应细胞（TEFF和TEXprog细胞）相同的全局组蛋白乙酰化水平。

图3：ACSS2与ACLY在效应T细胞（TEFF）和耗竭T细胞（TEX）中差异调控乙酰辅酶A生成及组蛋白乙酰化修饰。

5. 乙酸盐衍生的核内乙酰辅酶A促进TEXprog细胞形成

为确定乙酸介导的组蛋白乙酰化和TEXprog细胞分化是否由ACSS2介导的局部核内乙酰辅酶A产生驱动，研究构建了FLAG标记的ACSS2WT、ACSS2NLS（核定位信号标记）和ACSS2NES（核输出信号标记）的RV过表达载体，并转导体外激活的P14+CD8+T细胞。这些构建体在CD8+T细胞中产生了类似水平的ACSS2，且具有预期的细胞定位。乙酸依赖性组蛋白乙酰化在ACSS2NLS过表达的CD8+T细胞中最为显著，证明了核内ACSS2的直接表观遗传效应。研究用这三种ACSS2 RV或空载体（EV，pMIG）对照转导P14+ sgAcss2 CD8+ T细胞，并将供体细胞转移到随后感染LCMV-clone 13的小鼠体内。与EV对照和ACSS2NES过表达细胞相比，ACSS2WT和ACSS2NLS过表达的P14+sgAcss2 CD8+T细胞增加了总体和TEXprog供体P14+细胞的比例以及它们产生IFNγ和TNF的能力，尽管ACSS2NLS过表达的效果更为显著。综上所述，这些发现强调了乙酸衍生的核内乙酰辅酶A在组蛋白乙酰化和TEXprog细胞形成及功能中的关键作用。

6. ACSS2与ACLY分别与p300和KAT2A共定位

核内乙酰辅酶A通过组蛋白乙酰转移酶（HAT）的活性来修饰组蛋白。鉴于ACSS2和ACLY对TEX细胞分化和组蛋白乙酰化的影响，作者研究了ACSS2、ACLY与特定HAT之间潜在的协同作用。在P14+CD8⁺T细胞里，用CRISPR-Cas9把常见HAT基因逐一敲掉，再放入LCMV-clone 13慢性感染小鼠，看缺哪个HAT会改变 TEXprog/TEXterm的比例。结果显示，sgEp300和sgCrebbp增强了TEXterm细胞的形成，这与sgAcss2的作用相似；而sgKat2a则促进了TEXprog细胞的形成，这与sgAcly的作用类似（图4A）。这些数据表明，ACSS2与p300（由Ep300编码）或CBP（由Crebbp编码）之间，以及ACLY与KAT2A之间存在协同功能。

尽管p300和CBP在结构和功能上密切相关，通常被合称为p300/CBP，但作者将p300作为ACSS2的功能伙伴进行重点研究，因为在LCMV-克隆13感染期间，与sgCrebbp相比，sgEp300在增强TEXterm细胞和扩增病毒特异性CD8+T细胞方面表现出更强的效果（图4A）。相应地，p300蛋白在急性刺激的细胞中水平升高，而KAT2A在慢性刺激的细胞中水平上调，这与ACSS2和ACLY的蛋白水平及其各自对TEXprog与TEXterm细胞分化的影响相一致。然后，研究关注了蛋白共定位与相互作用。近邻连接实验（PLA）测“距离<40nm的蛋白”会亮，结果显示在TEFF（急性刺激）里，只看到ACSS2+p300的红点；在TEX（慢性刺激）里，只看到ACLY+KAT2A的红点；把ACSS2或ACLY敲掉，红点消失，证明特异（图4B和C）。Co-IP+Western blot实验和荧光显微镜也进一步证明内源性ACLY在TEX细胞中与KAT2A相互作用，但不与p300相互作用，而ACSS2在TEFF细胞中特异性地与p300共定位，但不与KAT2A共定位。

研究还进行了功能验证，在细胞里过表达“带核定位信号”的ACSS2（ACSS2^NLS），再把p300敲掉，TEXprog细胞积累还是起不来，说明ACSS2必须借p300才有作用；类似地，过表达ACLY^NLS+再敲Kat2a，则TEXprog得以“救回来”，说明ACLY的促TEXterm效应依赖KAT2A。ACSS2^NLS或ACLY^NLS本身都会提高H3K27ac水平，但前提分别是p300或KAT2A存在。

总体而言，这些结果表明ACSS2向p300提供核定位的乙酰辅酶A，促进TEXprog细胞的发育。然而，随着慢性刺激ACSS2的丰度下降，ACLY提供的乙酰辅酶A支持KAT2A的催化活性占主导地位，促进TEXterm细胞的形成。

图4：ACSS2与ACLY分别与p300和KAT2A发生相互作用。

7. ACSS2与ACLY分别协同p300和KAT2A，共同调控组蛋白乙酰化修饰

基于上面的数据，作如下假设：ACSS2-p300复合物通过控制特定基因位点的组蛋白修饰，来调控与TEXprog细胞相关的基因表达；而ACLY-KAT2A复合物则可能控制着决定TEXterm细胞分化的基因位点的乙酰化。在感染后第21天分选两类CD8⁺T细胞，做CUT&Tag测序，分别构建H3K27ac、H3K9ac、H4ac的差异修饰区域（DMR）的全基因组图谱。将DMR与其邻近基因进行关联分析后发现，TEXprog和TEXterm细胞中，各自“特征”基因（例如，TEXprog的Tcf7、Bach2和TEXterm的Havcr2、Il10）的乙酰化水平均有升高。但从全基因组角度看，TEXterm的乙酰化总量低于TEXprog（呼应前文流式检测）。

研究在P14+CD8+T细胞中敲除了Acss2、Acly、Ep300和Kat2a，并检查了它们在体外或体内的TEX分化，并对H3K27ac、H3K9ac和H4ac进行了CUT&Tag。如预期，由于慢性刺激的CD8+T细胞中ACSS2自然含量较低，sgAcss2和sgscramble CD8+T细胞之间观察到的差异修饰区域（DMR）很少。相比之下，将sgAcly细胞与对照组比较，约4838个DMR在H3K27ac、H3K9ac和H4ac上表现出同步增加，包括许多TEXprog特征位点（如Tcf7、Il7R、Sell、Tnf和Id3），而约8793个DMR在TEXterm特征基因位点（如Il10、Runx3、Havcr2和Entpd1）表现出同步减少（图5A和B）。

基因集富集分析（GSEA）进一步证实了sgAcly细胞中TEXprog分化的增强（图5C）。Motif分析显示，sgAcly T细胞中乙酰化增加的DMR高度富集于AP1-bZIP转录因子结合基序（如Fos、Jun、AP-1和ATF），这些与T细胞激活、效应功能以及防止CD8+T细胞耗竭相关，而乙酰化减少的DMR则富集于ETS转录因子家族成员（图5D）。此外，Acly和Kat2a依赖的H3K27ac DMR的全基因组重叠揭示了几个共同靶向位点，包括许多TEXterm位点。相比之下，sgAcly细胞中上调的DMR（作为Acss2依赖位点的代表）与Ep300依赖位点的重叠显示了许多TEXprog位点（图5E）。这进一步强调了ACLY和ACSS2分别以KAT2A和p300依赖的方式调节位点特异性组蛋白乙酰化，这与它们的物理相互作用和功能相互依赖性一致。

图5：ACSS2与ACLY分别协同p300和KAT2A，调控位点特异性的组蛋白乙酰化修饰。

8. 核内ACSS2促进TEXprog细胞分化

鉴于过表达ACSS2NLS能够促进LCMV-clone 13感染期间的组蛋白乙酰化和TEXprog分化，研究者推测这也可能对抗肿瘤免疫产生有益效果。为了验证这一点，研究在B16-GP33肿瘤植入后第10天将空载体对照或ACSS2NLS过表达的P14+T细胞过继转移到小鼠体内（图6A）。通过流式细胞术检测，在转移后第10天，ACSS2NLS过表达的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）显示全局H3K27ac和H3K9ac水平增加（图6B）。此外，对H3K27ac、H3K9ac和H4ac进行的CUT&Tag分析表明，ACSS2NLS过表达的肿瘤浸润淋巴细胞在TEXprog特征基因（如Tcf7和Bach2）处有特定的组蛋白乙酰化富集（图6，C和D）。而且，RNA-seq分析显示ACSS2NLS肿瘤浸润淋巴细胞中关键TEXprog相关基因（Id3、Egr2、Tcf7和Slamf6）表达增加，而关键TEXterm相关基因（Id2、Cish和Traf4）表达降低（图6E）。这些数据证明了核内ACSS2对TILs中TEXprog相关基因表达的影响。即把ACSS2强行送进细胞核（ACSS2^NLS过表达，简称OE）不仅能在慢性感染模型里促进TEXprog的形成，还能在肿瘤模型中改善肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的表观遗传状态和功能。

图6: 细胞核内ACSS2过表达促进TEXprog相关基因座组蛋白乙酰化并增强基因表达。

9. 核内ACSS2过表达和ACLY抑制与ICB协同增强抗肿瘤T细胞应答

研究测试了在肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）中强制表达核内ACSS2是否能增强αPD-L1免疫检查点阻断（ICB）的治疗效果。结果显示，与空载体（EV）对照组相比，过表达ACSS2-NLS的TILs无论是在单独作用还是与ICB联用时，其祖细胞样耗竭性T细胞（TEXprog）的形成均得到增强（图7A），细胞因子产量也更高（图7B）。它们还会迁移至缺氧区域附近。因此，过表达ACSS2-NLS的TILs能有效控制肿瘤，并与ICB表现出强大的协同作用（图7C）；而使用特异性抑制剂VY-3-135（49）抑制ACSS2则会削弱ICB介导的抗肿瘤免疫应答。

此外，鉴于ACSS2在Acly缺陷型CD8+T细胞中水平升高，研究推断直接抑制ACLY或许是另一种富集TEXprog细胞并提高ICB疗效的方法。的确，使用抑制剂BMS-303141抑制ACLY后，活化的CD8+T细胞中ACSS2的表达显著增强（图7D），并在体外耗竭培养中促进了TEXprog细胞的形成。同样地，在小鼠体内施用BMS-303141也轻微增加了TEXprog的形成，尽管在与ICB联用组中未观察到比单独使用ICB更显著的效果（图7E）。然而，BMS-303141与ICB的联合治疗极大地促进了TIL的累积，单独使用BMS-303141治疗也显示出类似趋势（图7F）。相应地，BMS-303141治疗能有效抑制肿瘤生长，并以一种依赖于CD8+T细胞的方式与ICB产生协同效应（图7G）。

图7：核内ACSS2过表达或ACLY抑制可增强CD8+T细胞的抗肿瘤免疫功能

   研究结论   

该研究揭示了在癌症和慢性病毒感染中，营养代谢对CD8+T细胞耗竭(TEX)分化的影响机制。研究发现TEX细胞通过下调乙酰辅酶A合成酶2(ACSS2)而维持ATP柠檬酸裂解酶(ACLY)活性,从而将代谢从乙酸转向柠檬酸。这种代谢转换通过KAT2A-ACLY相互作用增加了柠檬酸依赖的组蛋白乙酰化，同时通过p300-ACSS2复合物降低了乙酸依赖的组蛋白乙酰化。过表达核定位的ACSS2或抑制ACLY可以防止TEX分化并增强肿瘤特异性T细胞反应。这些发现揭示了一个调控CD8+T细胞分化的营养介导的组蛋白密码，为基于代谢和表观遗传的T细胞治疗提供了新思路。

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